技術與研究


背景

過敏是一種體內藉由IgE抗體為媒介所活化的免疫反應,後續並引發一系列的臨床症狀,如發癢、打噴嚏和流鼻水。血清中的過敏原特異性IgE (Allergen-specific IgE)濃度,和其佔血清中總量IgE (Total IgE)濃度的比例,與過敏症狀的發生有相當程度的關聯性註一。因此,血清IgE濃度的測定值在臨床上過敏症狀的診斷與控管,成為一項重要的參考資訊註二。目前臨床上針對IgE濃度的測定,所使用的人類IgE校正品皆參照世界衛生組織建立之人類血清IgE國際標準品註三。由於此IgE標準品的製備是透過混合捐血者的血清和血漿,這樣的來源會有感染性之病原體存在的疑慮,例如B肝病毒(HBV)、C肝病毒(HCV)或人類免疫缺乏病毒(HIV)的汙染,以及每批配製量用罄之問題。此外,在臨床過敏原IgE濃度的檢測系統中,由於缺乏過敏原特異性之人類IgE單株抗體(Monoclonal antibodies, mAbs),目前只能使用無特異性的人類IgE抗體作為測量校正品,加上IgE校正品的測量方法與過敏原IgE的測量方法有些差異,導致IgE濃度的換算上可能產生誤差,不同檢測廠商的測量結果也無法互相轉換。若能透過融合瘤技術(Hybridoma technologies),製備出生產過敏原特異性人類IgE單株抗體的融合瘤,或是透過基因工程技術,開發出物化性質一致的人源化IgE抗體,例如嵌合人類IgE單株抗體(Chimeric human IgE mAbs),再利用細胞或基因轉殖動物來生產抗體,將有機會解決上述的幾個問題。
 

專利基因嵌入小鼠

我們利用基因轉殖動物之技術,將組成人類IgE抗體分子的ε重鏈(Heavy chain)和κ輕鏈(Light chain)之編碼基因(Encoding genes),分別嵌入(Knock-in)小鼠胚胎幹細胞(Embryonic stem cells, ES cells)的γ1重鏈和κ輕鏈基因之位置(如圖一),接著把胚胎幹細胞分別植入孕母鼠體內,並將其帶有嵌入基因之成鼠交互配種,最後得到帶有人類IgE抗體重鏈和輕鏈基因的基因嵌入小鼠(HεκKI mice)註四,且體內能製造完整的嵌合人類IgE抗體分子(如圖一)。
 

圖一
 
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嵌合人類IgE單株抗體的製備

我們利用基因重組與蛋白質表現技術,將過敏原成分(Allergen components)製備成重組蛋白質,並用此蛋白質來免疫基因嵌入小鼠,讓小鼠體內產生具有過敏原特異性的嵌合人類IgE抗體和分泌該抗體的B淋巴細胞。接著藉由融合瘤技術與酵素結合免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)的篩選,得到能分泌過敏原特異性嵌合人類IgE單株抗體的IgE融合瘤。嵌合人類IgE單株抗體可從IgE融合瘤的培養基,或將IgE融合瘤注射至小鼠腹腔,從小鼠產生的腹水中,使用KappaSelect resin來純化取得。
 

純度與穩定度

我們將培養融合瘤的培養基與小鼠的腹水,利用KappaSelect resin來純化嵌合人類IgE單株抗體,並測試這兩種不同來源的抗體純化後的蛋白質純度。我們分別從培養基純化Der p 1-specific chimeric human IgE (DP1-IgE),從腹水純化Der p 2-specific chimeric human IgE (DP2-IgE),結果如圖二的SDS-PAGE分析圖所示(Lane 2與Lane 5)。純化後得到的嵌合人類IgE單株抗體純度都相當高(>98%),重鏈與輕鏈的分子量大小也都在估計的相對位置上。另外,我們將嵌合人類IgE抗體放在37度C下靜置48小時,或使其承受重複的-20度C冷凍/室溫解凍的五次循環,再透過SDS-PAGE分析,觀察抗體分子是否有斷裂的情形。如圖二所示,嵌合人類IgE抗體在這兩種測試的條件下,皆保持分子的完整性,並無斷裂的情況發生。這表示我們所製備的嵌合人類IgE抗體,在此儲存濃度(1 mg/mL)下,可提供抗體本身相當程度的穩定性。
 

圖二
 
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特異性

我們利用ELISA來測試嵌合人類IgE單株抗體,在蛋白質成份比較多樣的阻塞溶液(Blocking buffer)中,是否還能專一地結合至其過敏原,不受其他蛋白質成分干擾。如圖三所示,具有Der p 1或Der p 2特異性之嵌合人類IgE單株抗體註五,在牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)、脫脂牛奶(Non-fat milk, NFM)或人類血清(Human serum, HS)的阻塞溶液中,皆能專一地辨識其過敏原,結合強度無顯著的受影響。
 

圖三
 
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細胞活性

媒介巨大細胞(Mast cells)與嗜鹼細胞(Basophil)被過敏原的活化,是IgE抗體在人體內引發最主要的生物化學反應。我們測試嵌合人類IgE抗體在這方面是否與人類IgE抗體性質一致,結合至嗜鹼細胞株(RBL SX-38)表面的人類IgE受體(FcεRI receptors),在抗原或交聯抗體的存在下,刺激嗜鹼細胞釋放過敏介質(Allergic mediators)。我們先將相同濃度的人類IgE抗體或具有木瓜酵素(Papain)特異性之嵌合人類IgE單株抗體(PAP-IgE),加入嗜鹼細胞株的培養基中,經過一段時間培養後,再加入交聯抗體(Cross-linking antibodies)或特異性抗原(Specific antigens),接著測量培養基中,細胞所釋放出的過敏介質β-hexosaminidase的百分比。如圖四所示,在交聯抗體Goat anti-human IgE或特異性抗原Papain的刺激下,嵌合人類IgE單株抗體皆能引發嗜鹼細胞株釋放過敏介質,釋放程度與使用人類IgE抗體的程度相近。
 

圖四
 
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IgE校正品 (IgE calibrator)

在血清過敏原特異性IgE抗體的濃度檢測中,IgE校正品是用來將血清樣品所測得的化學訊號,轉換成IgE濃度的相對標準品。IgE校正品常使用如圖五Method A的方法,來做出校正用的結合曲線(Binding curve),而過敏原特異性IgE抗體的測量,是利用如圖五Method B的方法,來得到其結合至特定抗原的訊號。若IgE校正品分別使用這兩種方法測量,結果可能會產生不同的結合曲線。為此,我們利用ELISA來分析嵌合人類IgE單株抗體,在這兩種測量方法下所得到的結合曲線如圖六所示,三種嵌合人類IgE單株抗體,在Method A (Anti-IgE capture mAbs)的方法下,得到的結合曲線與使用人類IgE抗體一致,結合曲線之間的誤差很小;但用Method B (Specific antigens)得到結果卻顯示,每種嵌合人類IgE單株抗體的結合曲線不同,與人類IgE抗體的結合曲線比較,其差異也相當大,影響的因素可能來自於測量方法、抗原的種類與抗體的親和力不同所造成。若IgE校正品結合曲線的建立,與過敏原特異性IgE抗體的測量,能使用相同的方法(Method B)與條件(相同的特定抗原),如此校正曲線所換算出來的結果將會更一致、更準確,而嵌合人類IgE單株抗體可以滿足這些方面的需求。
 

圖五
 
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圖六
 
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我們的技術與嵌合人類IgE抗體的優勢:

  • 容易製備IgE融合瘤與IgE單株抗體
  • 過敏原特異性
  • 良好的親和力與專一性
  • 高純度與穩定
  • 可結合至嗜鹼細胞上的IgE受體與刺激細胞
  • 可大量生產與高濃度製備
  • 非人類血液來源(相較於血清IgE抗體)
  • 適合作為檢測用的校正品

 

註一:Hamilton RG, et al., IgE antibody-specific activity in human allergic disease. Immunol. Res. 2010;47:273-284

註二:Hamilton RG, et al., Human IgE antibody serology: A primer for the practicing North American allergist/immunologist. J. Allergy Clin. Immunol. 2010;126:33-38

註三:Thorpe SJ, et al., The 3rd International Standard for serum IgE: international collaborative study to evaluate a candidate preparation. Clin. Chem. Lab. Med. 2014;52:1283-1289

註四:Lu C-S, et al., Generating allergen-specific human IgEs for immunoassays by employing human ε gene knock-in mice. Allergy 2015;70:384-390

註五:DP2-IgE (2B12)是由INDOOR Biotechnologies公司所生產的Der p 2特異性之嵌合人類IgE單株抗體。